北京恒奧德儀器儀表有限公司
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恒奧德儀器紫外分析儀的原理及其應(yīng)用
紫外分析儀是熒光術(shù)的應(yīng)用，熒光術(shù)是什么呢? 了解下什么是熒光，熒光又作"螢光"，是種光致發(fā)光的冷發(fā)光現(xiàn)象。當(dāng)某種常溫物質(zhì)經(jīng)某種波長(zhǎng)的入射光(通常是紫外線(xiàn)或X射線(xiàn))照射，吸收光能后入激發(fā)態(tài)，并且立即退激發(fā)并發(fā)出比入射光的的波長(zhǎng)長(zhǎng)的出射光(通常波長(zhǎng)在可見(jiàn)光波段);而且旦停止入射光，發(fā)光現(xiàn)象也隨之立即消失。具有這種性質(zhì)的出射光就被稱(chēng)之為熒光。 知道了什么是熒光，顧名思義就能想到什么是熒光術(shù)。熒光術(shù)是某些物質(zhì)受定波長(zhǎng)的光激發(fā)后，在短時(shí)間內(nèi)(10-8秒)會(huì)發(fā)射出波長(zhǎng)大于激發(fā)波長(zhǎng)的光，這種光稱(chēng)為熒光。這發(fā)光現(xiàn)象在各方面的應(yīng)用及有關(guān)的方法稱(chēng)為熒光術(shù)(fluorescent technique)。
物質(zhì)經(jīng)過(guò)紫外線(xiàn)照射后發(fā)出熒光的現(xiàn)象可分為兩種情況，，如葉綠素、血紅素等經(jīng)紫外線(xiàn)照射后，能發(fā)出紅色的熒光，稱(chēng)為自發(fā)熒光;二種是誘發(fā)熒光，即物體經(jīng)熒光染料染色后再通過(guò)紫外線(xiàn)照射發(fā)出熒光，稱(chēng)為誘發(fā)熒光。
熒光術(shù)在生物化學(xué)及分子生物學(xué)研究中應(yīng)用主要包括以下幾個(gè)方面:
1、物質(zhì)的定性:不同的熒光物質(zhì)有不同的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜，因此可用熒光行物質(zhì)的鑒別。與吸收光譜法相比，熒光法具有更的選擇性。
2、定量測(cè)定:利用在較低濃度下熒光強(qiáng)度與樣品濃度成正比這關(guān)系可以定量分析樣品中熒光組分的含量，常用于測(cè)定氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸的含量。熒光定量測(cè)定的個(gè)優(yōu)點(diǎn)是靈敏度，例如維生素B2的測(cè)定*可達(dá)1毫微克/毫升，這優(yōu)點(diǎn)使測(cè)定時(shí)所需要樣品量大大減少。 這種定量測(cè)定方法還可應(yīng)用于酶催化的反應(yīng)，只要反應(yīng)前后有熒光強(qiáng)度的變化，就可用來(lái)測(cè)定酶的含量及酶反應(yīng)的速率等。
3、研究生物大分子的物理化學(xué)特性及其分子的結(jié)構(gòu)和構(gòu)象:熒光的激發(fā)光譜、發(fā)射光譜、量子產(chǎn)率和熒光壽命等參數(shù)不僅和分子內(nèi)熒光發(fā)色基團(tuán)的本身結(jié)構(gòu)有關(guān)，而且還強(qiáng)烈地依賴(lài)于發(fā)色團(tuán)周?chē)沫h(huán)境，即對(duì)周?chē)h(huán)境十分敏感。利用此特點(diǎn)可通過(guò)測(cè)定上述有關(guān)熒光參數(shù)的變化來(lái)研究熒光發(fā)色團(tuán)所在位的微環(huán)境的特征及其變化。在此研究中，除了利用生物大分子本身具有的熒光發(fā)色團(tuán)(如色氨酸、酪氨酸、鳥(niǎo)苷酸等，此類(lèi)熒光稱(chēng)為內(nèi)源熒光)以外，可將些特殊的熒光染料分子共價(jià)地結(jié)合或吸附在生物大分子的某位，通過(guò)測(cè)定該染料分子的熒光特性變化來(lái)研究生物大分子，這種染料分子被稱(chēng)為"熒光探針"，它們發(fā)出的熒光般稱(chēng)為外源熒光。熒光探針的應(yīng)用，大大地開(kāi)拓了熒光術(shù)在分子生物學(xué)中的應(yīng)用范圍。
4、利用熒光壽命、量子產(chǎn)率等參數(shù)可以研究生物大分子中的能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象:通過(guò)該現(xiàn)象的研究，可以獲得生物大分子內(nèi)的許多信息。
以往人們常用熒光偏振做標(biāo)來(lái)研究生物大分子動(dòng)力學(xué)。人們趨于用熒光偏振隨時(shí)間的衰減來(lái)研究這些問(wèn)題。在這種方法中，激發(fā)光不是連續(xù)的面偏振光，而是偏振的光脈沖，因此測(cè)得的F∥和F是在兩個(gè)不同方向上偏振的熒光隨時(shí)間的衰減，它既和熒光壽命τ有關(guān)，又與分子在溶液中的運(yùn)動(dòng)有關(guān)，因此常表示為F∥(t)和F⊥(t)。由它們可得相當(dāng)重要的物理量--各向異性參數(shù)A(t)。由A(t)可推測(cè)生物大分子的形狀、分子轉(zhuǎn)動(dòng)弛豫時(shí)間(即從個(gè)定向的狀態(tài)到個(gè)無(wú)定向狀態(tài)所要的時(shí)間)，而可以推知生物大分子的大小、分子在溶液中的轉(zhuǎn)動(dòng)角度和時(shí)間之間的函數(shù)關(guān)系。由這些結(jié)果可以研究分子之間的相互作用、分子間結(jié)合的緊密程度、蛋白質(zhì)、核酸分子的解聚程度等等。
