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倒置生物顯微鏡工作原理選型、操作與維護(hù)

折射和折射率

光線在均勻的各向同性介質(zhì)中，兩點(diǎn)之間以直線傳播，當(dāng)通過(guò)不同密度介質(zhì)的透明物體時(shí)，則發(fā)生折射現(xiàn)象，這是由于光在不同介質(zhì)的傳播速度不同造成的。當(dāng)與透明物面不垂直的光線由空氣射入透明物體 (如玻璃)時(shí)，光線在其介面改變了方向，并和法線構(gòu)成折射角。

透鏡是組成顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)的最基本的光學(xué)元件，物鏡目鏡及聚光鏡等部件均由單個(gè)和多個(gè)透鏡組成。依其外形的不同，可分為凸透鏡(正透鏡)和凹透鏡(負(fù)透鏡)兩大類。

當(dāng)一束平行于光軸的光線通過(guò)凸透鏡后相交于一點(diǎn)，這個(gè)點(diǎn)稱"焦點(diǎn)"，通過(guò)焦點(diǎn)并垂直光軸的平面，稱"焦平面"。焦點(diǎn)有兩個(gè)，在物方空間的焦點(diǎn)，稱"物方焦點(diǎn)"，該處的焦平面，稱"物方焦平面"；反之，在象方空間的焦點(diǎn)，稱"象方焦點(diǎn)"，該處的焦平面，稱"象方焦平面"。

光線通過(guò)凹透鏡后，成正立虛像，而凸透鏡則成正立實(shí)像。實(shí)像可在屏幕上顯現(xiàn)出來(lái)，而虛像不能。

凸透鏡成象規(guī)律

1. 當(dāng)物體位于透鏡物方二倍焦距以外時(shí)，則在象方二倍焦距以內(nèi)、焦點(diǎn)以外形成縮小的倒立實(shí)象；

2. 當(dāng)物體位于透鏡物方二倍焦距上時(shí)，則在象方二倍焦距上形成同樣大小的倒立實(shí)象；

3. 當(dāng)物體位于透鏡物方二倍焦距以內(nèi)，焦點(diǎn)以外時(shí)，則在象方二倍焦距以外形成放大的倒立實(shí)象；

4. 當(dāng)物體位于透鏡物方焦點(diǎn)上時(shí)，則象方不能成象；

5. 當(dāng)物體位于透鏡物方焦點(diǎn)以內(nèi)時(shí)，則象方也無(wú)象的形成，而在透鏡物方的同側(cè)比物體遠(yuǎn)的位置形成放大的直立虛象。

選型、操作與維護(hù)

選型

倒置生物顯微鏡的選型需根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行綜合考量。應(yīng)優(yōu)先選用長(zhǎng)工作距離物鏡，選擇時(shí)需綜合計(jì)算物鏡工作距離、培養(yǎng)瓶底部厚度與液層高度，并預(yù)留安全余量。針對(duì)較厚的培養(yǎng)器皿，建議選用工作距離更大的長(zhǎng)工作距離物鏡。若需進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間活細(xì)胞觀測(cè)或拍攝，應(yīng)選擇配備溫控與CO?維持系統(tǒng)的顯微鏡以維持細(xì)胞活性。根據(jù)實(shí)驗(yàn)發(fā)展需求，可考慮選擇支持模塊化擴(kuò)展的機(jī)型，便于未來(lái)升級(jí)熒光、相差增強(qiáng)等高級(jí)功能 [33]。

操作

操作時(shí)，調(diào)焦應(yīng)先粗調(diào)至培養(yǎng)瓶底反光面，再緩慢向上微調(diào)找到細(xì)胞層，力度需輕柔以避免物鏡頂碎培養(yǎng)瓶。進(jìn)行相差觀察時(shí)，必須確保聚光鏡的相差環(huán)與物鏡的放大倍數(shù)及相位類型匹配，切換物鏡時(shí)需同步調(diào)整聚光鏡上的相差環(huán)至對(duì)應(yīng)位置，并避免在活細(xì)胞觀察中使用油鏡以防培養(yǎng)液污染鏡頭。顯微鏡的清晰度核心取決于物鏡的數(shù)值孔徑而非單純放大倍數(shù)，有效放大倍率約等于物鏡數(shù)值孔徑乘以1000，常規(guī)細(xì)胞觀察一般100倍至200倍已足夠 [33]。倒置熒光顯微鏡通常只會(huì)配40倍物鏡，因此放大倍率、分辨率不如正置熒光顯微鏡